文章信息
文章題目：Amplification editing enables efficient and precise duplication of DNA from short sequence to megabase and chromosomal scale
期刊：Cell
發(fā)表時間：2024年6月26日
主要內(nèi)容：武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院、中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究院、教育部免疫與代謝前沿科學(xué)中心、泰康生命醫(yī)學(xué)中心殷昊教授課題組在Cell期刊發(fā)表題為Amplification editing enables efficient and precise duplication of DNA from short sequence to megabase and chromosomal scale的研究性論文。本項工作研發(fā)了一種名為Amplification Editing（AE）的方法，以可編程的方式精確高效地復(fù)制從小片段到包含特定染色體大部分區(qū)域的基因組序列，是一種高效精確的基因組結(jié)構(gòu)編輯工具，將精準(zhǔn)復(fù)制的范圍從單個基因位點擴展到染色體層面。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.056
使用TransGen產(chǎn)品：
pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit (CU201)
Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell (CD501)
研究背景
基因擴增（基因重復(fù)）是指在生物體內(nèi)復(fù)制DNA片段，形成重復(fù)序列。擴增范圍從幾個堿基對到染色體大部分區(qū)域?；驍U增是一種染色體的結(jié)構(gòu)變異，在進(jìn)化、遺傳性疾病和癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。現(xiàn)有的基因編輯工具能做到單個位點的精準(zhǔn)編輯，但是缺乏高效精確的基因組結(jié)構(gòu)編輯工具。
文章概述
首先，課題組在11個細(xì)胞系的多個位點進(jìn)行了驗證。在AE復(fù)制長度和效率方面，當(dāng)復(fù)制的DNA長度為20 bp至8 Kb時，AE可進(jìn)行多次復(fù)制，形成串聯(lián)重復(fù)序列。當(dāng)復(fù)制長度為1 Mb時，AE的編輯效率最高達(dá)73.0%；復(fù)制長度為100 Mb（接近人類染色體的平均長度）時，效率達(dá)到3.4%。通過原位熒光雜交、核型分析、全基因組測序等實驗，可以直接觀察到染色體區(qū)域的復(fù)制。在AE編輯的精準(zhǔn)度方面，連接處的二代測序和全長的三代測序數(shù)據(jù)顯示，indels均低于1%。
其次，課題組利用AE精準(zhǔn)修正了綠色熒光蛋白序列和實現(xiàn)miRNA的內(nèi)源性過表達(dá)。同時，課題組在髓性白血病細(xì)胞系K562中建立了α地中海貧血癥模型，并測試了AE的效果，實現(xiàn)了HBA基因的mRNA水平的提高和 α/γ-珠蛋白比例的上升。這些結(jié)果表明AE能夠恢復(fù)基因表達(dá)、擴增miRNA并增加模型細(xì)胞系中的α-珠蛋白的表達(dá)。
接下來，AE在人源和鼠源干細(xì)胞的多個位點均實現(xiàn)了高效精準(zhǔn)的短片段和Mb級別編輯，模擬了染色體微重復(fù)疾病的基因型，并使用全基因組測序驗證了編輯的精準(zhǔn)性。這表明AE能夠精準(zhǔn)構(gòu)建超大片段復(fù)制相關(guān)的疾病模型。
最后，該研究對AE的機制進(jìn)行了初步探究。在被抑制細(xì)胞周期的RPE-1細(xì)胞中，AE的效率降低。在小鼠原代神經(jīng)元中，AE只可實現(xiàn)短片段的復(fù)制。這說明AE在Mb級別的復(fù)制可能依賴于細(xì)胞周期。
綜上所述，該研究開發(fā)了一種名為“Amplification Editing（AE）”的基因組編輯工具，可實現(xiàn)從短片段到染色體長度的精準(zhǔn)復(fù)制。該工具的開發(fā)可促進(jìn)基因組疾病模型的建立，推動基因進(jìn)化和癌癥機制相關(guān)的研究。
全式金生物產(chǎn)品支撐
優(yōu)質(zhì)的試劑是科學(xué)研究的利器。全式金生物無縫克隆試劑盒pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit (CU201)和Trans1-T1 克隆感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1 Phage Resistant ?Chemically Competent Cell (CD501)助力本研究。
pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit (CU201)
本產(chǎn)品利用特殊的重組酶和同源重組的原理，可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有15-25 bp重疊區(qū)域的PCR片段定向重組，可以實現(xiàn)1-5個片段的高效無縫拼接。
產(chǎn)品特點：
● 快速：僅需要5~15分鐘反應(yīng)時間。
● 簡單：不受片段酶切位點的影響，無需對片段酶切。
● 高效：陽性率達(dá)95% 以上。
● 無縫：不引入額外的序列。
實驗數(shù)據(jù)
單片段連接
使用 TransGen 產(chǎn)品，將 5 個不同長度片段（0.5 kb,1.2 kb,1.4 kb,1.8 kb,3.9 kb）混合后插入載體中，酶切鑒定插入效果。結(jié)果表明，不同長度的片段均正確插入載體，成功進(jìn)行多片段連接。
多片段連接
1 kb PCR片段插入pUC19載體后，PCR鑒定插入效果。結(jié)果顯示，插入片段的陽性率達(dá) 100%。
Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell (CD501)
本產(chǎn)品經(jīng)特殊工藝制作，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化。使用pUC19質(zhì)粒DNA檢測，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)109 cfu/μg DNA以上。
產(chǎn)品特點：
● Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞是目前生長速度最快的感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素平板上，8-9 小時可見克隆。
● 用于藍(lán)、白斑篩選，12 小時可見藍(lán)斑。
● 將過夜培養(yǎng)的單克隆在2 mL的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-5小時即可進(jìn)行小量質(zhì)粒提取。
● 適用于高效的DNA 克隆和質(zhì)粒擴增，減少克隆DNA同源重組的發(fā)生，提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。
● 具有T1，T5噬菌體抗性。
全式金生物產(chǎn)品再一次登上Cell期刊，證明了大家對全式金生物產(chǎn)品品質(zhì)和實力的認(rèn)可，也完美詮釋了全式金生物一直以來秉承的“品質(zhì)高于一切，精品服務(wù)客戶”的理念。全式金生物始終在助力科研的道路上砥礪前行，希望未來能與更多的科研工作者并肩奮斗，用更多更好的產(chǎn)品持續(xù)助力科研。
使用pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit (CU201) 產(chǎn)品發(fā)表的部分文章：
? Zhang R W, Zhou H, et al. Amplification editing enables efficient and precise duplication of DNA from short sequence to megabase and chromosomal scale [J]. Cell, 2024.
? Zhang Y , Dai F , Chen N ,et al.Structural insights into VAChT neurotransmitter recognition and inhibition[J].Cell Research, 2024.
? Chunyu J, Chengzhi Y, et al.A new anti-CRISPR gene promotes the spread of drug-resistance plasmids in Klebsiella pneumoniae[J].Nucleic Acids Research, 2024.
? You L, Omollo E O, Yu C, et al. Structural basis for intrinsic transcription termination[J]. Nature, 2023.
? Huang J, Yang L, Yang L, et al. Stigma receptors control intraspecies and interspecies barriers in Brassicaceae[J]. Nature, 2023.
? Jiang L, Xie X, Su N, et al. Large Stokes shift fluorescent RNAs for dual-emission fluorescence and bioluminescence imaging in live cells[J]. Nature Methods, 2023.
? Bai X , Sun P , et al. Zhe.Structure and dynamics of the EGFR/HER2 heterodimer[J].cell discovery, 2023.
使用Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell (CD501)產(chǎn)品發(fā)表的部分文章：
? Zhang R W, Zhou H, et al. Amplification editing enables efficient and precise duplication of DNA from short sequence to megabase and chromosomal scale [J]. Cell, 2024.
? Wang C, Wang J, Lu J, et al. A natural gene drive system confers reproductive isolation in rice[J]. Cell, 2023.
? Shan L, Xu G, Yao R W, et al. Nucleolar URB1 ensures 3′ ETS rRNA removal to prevent exosome surveillance[J]. Nature, 2023.
? Luo Y, Liu S, Xue J, et al. High-throughput screening of spike variants uncovers the key residues that alter the affinity and antigenicity of SARS-CoV-2[J]. Cell Discovery, 2023.
? Lei Z, Meng H, Liu L, et al. Mitochondrial base editor induces substantial nuclear off-target mutations[J]. Nature, 2022.
? Zhang Q, Zhang X, Zhu Y, et al. Recognition of cyclic dinucleotides and folates by human SLC19A1[J]. Nature, 2022.
? Li Y, Zhao L, Zhang Y, et al. Structural basis for product specificities of MLL family methyltransferases[J]. Molecular Cell, 2022.
? Wang D, Xu C, Yang W, et al. E3 ligase RNF167 and deubiquitinase STAMBPL1 modulate mTOR and cancer progression[J]. Molecular cell, 2022.
