等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)系列
近些年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展持續(xù)推動(dòng)著分子診斷技術(shù)的升級(jí)迭代，伴隨著新冠疫情的爆發(fā)，分子診斷技術(shù)在疾病診斷中發(fā)揮著重大作用，人們對(duì)分子診斷技術(shù)的重視程度達(dá)到了前所未有的高度。自沃森和克里克揭秘“生命之謎”-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)始，分子診斷經(jīng)分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)和二代測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展后，已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，如傳染病的診斷、流行病學(xué)的調(diào)查、腫瘤和遺傳病的早期診斷、食品衛(wèi)生安全等。
其中，作為分子診斷經(jīng)典技術(shù)之一的PCR，憑借其簡(jiǎn)便快速、高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢(shì)，成為目前臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室接受程度最高、應(yīng)用范圍最廣的技術(shù)。然而，PCR技術(shù)是在體外通過(guò)反復(fù)的溫度變化來(lái)達(dá)到對(duì)目的片段在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍的效果，這也就意味著PCR技術(shù)無(wú)法擺脫儀器設(shè)備的局限，不僅如此，PCR技術(shù)操作起來(lái)比較復(fù)雜，對(duì)人員要求也比較高，這些問(wèn)題進(jìn)一步限制了其在臨床現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用。為了解決PCR這一局限性，自20世紀(jì)90年代以來(lái)，很多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始自發(fā)的研究無(wú)需熱變性的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Isothermal Amplification Technology, IAT)。
等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)過(guò)程始終在一個(gè)恒定的溫度下進(jìn)行，通過(guò)在反應(yīng)體系中添加不同活性的酶和各種特異性的引物來(lái)達(dá)到快速擴(kuò)增的目的。經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展，主流的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物擴(kuò)增(crossing priming amplification，CPA)、鏈替代擴(kuò)增(strand displacement amplification，SDA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，RPA)、依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification，RCA)和依賴(lài)解旋酶的擴(kuò)增(helicase-dependent amplification，HDA)。
在這些恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中，以2000年日本學(xué)者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開(kāi)的LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)，也就是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)最受關(guān)注，是目前最常見(jiàn)、應(yīng)用最廣泛的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，已占據(jù)超過(guò)60%的恒溫檢測(cè)市場(chǎng)。被廣泛地運(yùn)用在病原微生物檢測(cè)和傳染性疾病診斷等領(lǐng)域，如SARS、AIV、HIV、COVID-19等疾病的檢測(cè)中，為已知基因的檢測(cè)提供簡(jiǎn)便、快速、特異、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，顯示出令人鼓舞的應(yīng)用前景。
LAMP原理
最初的LAMP反應(yīng)是針對(duì)目的DNA鏈上的6個(gè)區(qū)域（F3、F2、F1、B1、B2、B3）設(shè)計(jì)4條引物，包含一對(duì)外引物（F3&B3）和一對(duì)內(nèi)引物（FIP&BIP）。其原理是利用雙鏈DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在此溫度下，引物結(jié)合在雙鏈DNA的互補(bǔ)部位，鏈置換DNA聚合酶將DNA雙鏈解開(kāi)并進(jìn)行鏈置換，使DNA在15-60分鐘內(nèi)即可擴(kuò)增109-1010倍。
LAMP擴(kuò)增體系
基于LAMP擴(kuò)增的原理，LAMP的擴(kuò)增體系包括4條特異性引物、Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、MgSO4。
4條特異性引物的組成：
· 正向外引物F3：由F3區(qū)域組成，該區(qū)域與F3c區(qū)域互補(bǔ)；
· 反向外引物B3：由B3區(qū)域組成，該區(qū)域與B3c區(qū)域互補(bǔ)。
· 正向內(nèi)引物FIP：由與F2c區(qū)互補(bǔ)的F2區(qū)（3’端）和與5’端的F1c區(qū)相同序列組成。
· 反向內(nèi)引物BIP：由與B2c區(qū)互補(bǔ)的B2區(qū)（3'端）和與5'端的B1c區(qū)域相同序列組成。
LAMP引物設(shè)計(jì)
正確的引物設(shè)計(jì)對(duì)于進(jìn)行LAMP擴(kuò)增至關(guān)重要，LAMP引物設(shè)計(jì)時(shí)，需注意以下幾點(diǎn)：
· 引物間距：F2和B2的5'端之間的距離為120-180 bp，F(xiàn)2和F3以及B2和B3之間的距離為0-20 bp。莖環(huán)區(qū)域的距離（F2的5'到F1的3'，B2的5'到B1的3'）為40-60 bp。
· 引物的Tm值：高GC和正常情況下約60-65℃，高AT情況下約55-60℃。
· 引物末端的穩(wěn)定性：從以下末端區(qū)域計(jì)算6bp的dG應(yīng)小于-4 kcal/mol，分別是F1c/B1c 的5'末端和F2/B2以及F3/B3的3'末端。
· GC含量：高GC和正常的情況下約為50-60%，高AT的情況下約為40-50%。
· 二級(jí)結(jié)構(gòu)：引物設(shè)計(jì)應(yīng)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，3'序列應(yīng)避免高AT或與其他引物互補(bǔ)。
· 其他：如果目標(biāo)序列上存在限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，除了引物區(qū)域外，它們可以用來(lái)確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物。
LAMP反應(yīng)核心的Bst DNA聚合酶，源于Geobacillus stearothermophilus（嗜熱脂肪芽孢桿菌），原菌種生長(zhǎng)于55-60℃的環(huán)境中。野生型Bst DNA Polymerase和其他DNA Polymerase I相似，包括三個(gè)活性區(qū)域: (I) 5’-3’外切酶活性結(jié)構(gòu)域，(II) 5’-3’聚合酶活性結(jié)構(gòu)域，(III) 3’-5’外切酶活性結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域II和III稱(chēng)為大片段(LF)（大片段的反應(yīng)效率比全長(zhǎng)Bst高），位于Bst DNA聚合酶的羧基末端，缺失5’-3’外切酶活性。
Bst DNA聚合酶的鏈置換原理
LAMP擴(kuò)增步驟
當(dāng)目的基因和試劑在65℃條件下孵育時(shí)，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)分為2個(gè)階段進(jìn)行，分別是啞鈴狀模板結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程、循環(huán)擴(kuò)增階段以及延伸循環(huán)階段。步驟如下：
1. 啞鈴狀模板結(jié)構(gòu)的形成：內(nèi)引物結(jié)合目的基因，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸為雙鏈。外引物與雙鏈DNA的5’結(jié)合，在一端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。另一端經(jīng)過(guò)同樣過(guò)程，形成兩端為環(huán)的啞鈴狀結(jié)構(gòu)。
2. 循環(huán)擴(kuò)增階段以及延伸循環(huán)階段：以啞鈴結(jié)構(gòu)DNA單鏈自身為模板不斷形成一端開(kāi)口的過(guò)渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，由內(nèi)外引物引導(dǎo)過(guò)渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA不斷發(fā)生鏈置換延伸反應(yīng)，最后形成具有多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度不一的DNA混合物。
LAMP擴(kuò)增步驟
LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)
LAMP擴(kuò)增后可產(chǎn)生大量具有不同長(zhǎng)度、不同數(shù)目莖環(huán)結(jié)構(gòu)和反向重復(fù)序列的DNA混合物，此外，隨著擴(kuò)增反應(yīng)的不斷進(jìn)行，副產(chǎn)物焦磷酸鎂的含量也在不斷增加。由于LAMP反應(yīng)的特殊性，其擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)也存在多種方式。
· 瓊脂糖凝膠電泳法：通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)瀑布狀梯形條帶，針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物中所包含的特異性酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切，還可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。但高濃度DNA產(chǎn)物容易產(chǎn)生氣溶膠造成實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染。
· 濁度分析鑒定法：LAMP反應(yīng)的效率極高，核酸在大量合成的同時(shí)，由dNTP析出的焦磷酸根離子與體系中的鎂離子結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂，形成乳白色沉淀，焦磷酸鎂的產(chǎn)量與擴(kuò)增產(chǎn)物濃度存在一定相關(guān)性?？捎萌庋塾^察擴(kuò)增終末階段的乳白色沉淀判斷擴(kuò)增有效性，也可利用濁度儀對(duì)濁度變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。但濁度信號(hào)是來(lái)源于LAMP反應(yīng)的副產(chǎn)物，而不是由引物特異性擴(kuò)增的直接產(chǎn)物，因此無(wú)法完全排除檢測(cè)到非特異性擴(kuò)增（如，由宿主來(lái)源的近源DNA片段或引物二聚體）的可能。
· 染色檢測(cè)法：根據(jù)染料對(duì)反應(yīng)是否產(chǎn)生抑制，染料可在反應(yīng)后或反應(yīng)前添加。在反應(yīng)后開(kāi)蓋添加，易在空氣中產(chǎn)生氣溶膠，并在之后的檢測(cè)中造成假陽(yáng)性。染料和輔助劑的種類(lèi)也會(huì)對(duì)反應(yīng)效率及結(jié)果判斷造成影響。因此，根據(jù)染料、輔助劑的作用特點(diǎn)進(jìn)行合理的選擇及應(yīng)用，對(duì)LAMP結(jié)果的正確性和可靠性有重要意義。染料的種類(lèi)有很多，應(yīng)用較多的有3種：鈣黃綠素、SYBR Green 和羥基萘酚藍(lán)。
· 免疫試紙條法：特異性擴(kuò)增產(chǎn)物能夠同時(shí)被質(zhì)控線（C）和檢測(cè)線（T）上的抗體捕獲并顯現(xiàn)為兩條紅色條帶，而非特異性擴(kuò)增的樣品則僅僅顯示為質(zhì)控線（C）紅色，但該方法需要借助其他的裝置來(lái)防止核酸擴(kuò)增結(jié)束后開(kāi)蓋可能造成的交叉污染。
· 實(shí)時(shí)熒光法：利用SYBR Green I等熒光染料能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合的特性，通過(guò)核酸擴(kuò)增過(guò)程中的熒光強(qiáng)度變化來(lái)實(shí)時(shí)、定量地檢測(cè)雙鏈DNA的產(chǎn)量。該方法具有重復(fù)性高、能夠定量、實(shí)時(shí)分析的特點(diǎn)，但需要復(fù)雜的儀器，成本高。
· 熒光探針?lè)ǎ合騆AMP反應(yīng)體系中加入標(biāo)記不同熒光素的特異性探針，可用于多重基因的檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。但需要復(fù)雜的儀器，成本高。
· 微流控芯片法：該方法具有特異性強(qiáng)、敏感度高、耗樣量少、耗時(shí)短、檢測(cè)效率高、操作簡(jiǎn)便等諸多優(yōu)點(diǎn)。將環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增和微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，建立單重/多重、定性/定量的LAMP微流控芯片模塊，有利于發(fā)展快速、靈敏、特異和適合床邊檢測(cè)的生物分子分析技術(shù)。但需要復(fù)雜的儀器，成本高。
LAMP的優(yōu)勢(shì)與限制
LAMP的優(yōu)勢(shì)：
· 不需額外的步驟將雙鏈DNA變成單鏈DNA；
· 擴(kuò)增反應(yīng)在等溫條件下連續(xù)進(jìn)行；
· 擴(kuò)增效率極高，在15-60分鐘內(nèi)使DNA的量放大109-1010倍；
· 通過(guò)4個(gè)引物來(lái)識(shí)別6個(gè)區(qū)域，擴(kuò)增的特異性強(qiáng)；
· 不需要特殊的試劑或復(fù)雜的設(shè)備，成本低；
· RNA模板的擴(kuò)增過(guò)程與DNA模板相同，只需添加逆轉(zhuǎn)錄酶。
LAMP的限制：
· 引物設(shè)計(jì)要求高；
· 產(chǎn)物不能用于克隆或測(cè)序；
· 容易形成氣溶膠污染，造成假陽(yáng)性。
產(chǎn)品推薦
全式金作為國(guó)產(chǎn)生物試劑優(yōu)質(zhì)供應(yīng)商，為滿足廣大客戶對(duì)LAMP技術(shù)在病原微生物檢測(cè)、傳染性疾病診斷和食品衛(wèi)生安全等領(lǐng)域的應(yīng)用需求，推出Bst II DNA Polymerase和Bst III DNA Polymerase，助力診斷試劑開(kāi)發(fā)。
適用于以DNA為模板的LAMP反應(yīng)，擴(kuò)增能力強(qiáng)、特異性高，在熒光定量法（染料法、探針?lè)ǎ㎜AMP反應(yīng)中具有極佳的反應(yīng)性能。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
· 操作簡(jiǎn)單：包含反應(yīng)所需組分，只需自備模板及引物探針即可；
· 高效率：強(qiáng)鏈置換及聚合酶活性，實(shí)現(xiàn)恒溫條件下快速、高效、特異性的LAMP擴(kuò)增；
· 兼容dUTP/UDG：對(duì)dUTP耐受性好，添加dUTP/UDG有效防止LAMP產(chǎn)物的交叉污染，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：
兼容dUTP/UDG防污染系統(tǒng)
以ASFV-p72質(zhì)粒和Pre-LAMP Product為模板，使用TransGen產(chǎn)品進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品對(duì)dUTP耐受性好，高度兼容dUTP/UDG系統(tǒng)，有效避免交叉污染。
擴(kuò)增靈敏度高
以不同濃度的番鴨細(xì)小病毒（MDPV）質(zhì)粒為模板，使用TransGen產(chǎn)品進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品擴(kuò)增靈敏性高，特異性好，檢出限可到fg級(jí)別。
注：1*102 copies濃度為fg級(jí)別
擴(kuò)增速率快
在同等模板濃度條件下，分別使用TransGen產(chǎn)品和Company N產(chǎn)品進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品擴(kuò)增速率更快。
反應(yīng)可視化
以ASFV-p72基因質(zhì)粒為模板，使用TransGen產(chǎn)品進(jìn)行濁度法、HNB和中性紅顯色法LAMP擴(kuò)增，63℃反應(yīng)30 min。結(jié)果表明TransGen產(chǎn)品可進(jìn)行可視化操作，擴(kuò)增結(jié)果均可通過(guò)顏色變化進(jìn)行判讀。
1-4：ASFV-p72基因質(zhì)粒；5-8：NTC
Bst III DNA Polymerase (LP311)
適用于以RNA為模板的RT-LAMP反應(yīng)，具有極強(qiáng)的反轉(zhuǎn)錄活性和擴(kuò)增能力，可在30分鐘內(nèi)檢測(cè)低至1拷貝的RNA分子，適用于熒光染料法、熒光探針?lè)ā?/span>
產(chǎn)品特點(diǎn)：
· 操作簡(jiǎn)單：包含反應(yīng)所需組分，只需自備模板及引物探針即可；
· 高效率：一步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT）及LAMP擴(kuò)增，恒溫條件下快速、高效、特異性的擴(kuò)增模板；
· 兼容dUTP/UDG：對(duì)dUTP 耐受性好，添加dUTP/UDG有效防止LAMP產(chǎn)物的交叉污染，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確；
· 提供可凍干反應(yīng)體系：高濃度Bst III酶活穩(wěn)定，可用于凍干反應(yīng)體系的建立。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：
擴(kuò)增效率高
以鴨、鵝呼腸孤病毒（DuRV）體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，分別使用TransGen產(chǎn)品和Company N產(chǎn)品進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品擴(kuò)增效率更高。
擴(kuò)增靈敏度高
以不同濃度的鴨、鵝呼腸孤病毒（DuRV）體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，使用TransGen產(chǎn)品進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品擴(kuò)增靈敏性高，特異性好，檢出限可到fg級(jí)別。
注：1 copy濃度為fg級(jí)別
可進(jìn)行凍干
以鴨、鵝呼腸孤病毒（DuRV）體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，使用常規(guī)和凍干體系 TransGen產(chǎn)品進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品擴(kuò)增效果穩(wěn)定，可用于凍干體系研究。
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