2024 諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)：microRNA 開(kāi)啟基因調(diào)控新維度
2024 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的頒布，再次吸引了全球科學(xué)界的目光。今年，這一殊榮授予了兩位科學(xué)家：Victor Ambros和Gary Ruvkun，他們因發(fā)現(xiàn)microRNA及其在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用，獲得2024年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
圖1 2024年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)?wù)?，Victor Ambros和Gary Ruvkun
microRNA 的發(fā)現(xiàn)過(guò)程
故事要從 20 世紀(jì) 80 年代末說(shuō)起，Ambros和Ruvkun一直在研究秀麗隱桿線蟲(chóng)（現(xiàn)在都已成為模式生物了）的生命進(jìn)程，他們將目標(biāo)鎖定在了兩個(gè)突變株 “l(fā)in-4” 和 “l(fā)in-14”上。Ambros驚奇地發(fā)現(xiàn)，lin-4 基因仿佛是 lin-14 基因的神秘 “負(fù)調(diào)控者”，但其中的抑制機(jī)制卻如同籠罩在一層迷霧之中，讓人捉摸不透。
時(shí)光流轉(zhuǎn)，Ambros直到博士后生涯結(jié)束，才在哈佛大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室里意外迎來(lái)了重大突破。他發(fā)現(xiàn)，lin-4 基因抑制 lin-14 基因的原因，極有可能是 lin-4 產(chǎn)生的一種超短 RNA。與此同時(shí)，Ruvkun也有了驚人發(fā)現(xiàn)，他察覺(jué)到 lin-4 并不影響 lin-14 基因產(chǎn)生mRNA，而是阻止 mRNA 產(chǎn)生蛋白質(zhì)。并且，他還找到了 lin-14轉(zhuǎn)錄mRNA 上的一個(gè)關(guān)鍵位置，這個(gè)位置就是 lin-4 對(duì)其進(jìn)行抑制的結(jié)合位點(diǎn)。
當(dāng)Ambros和Ruvkun交流彼此的發(fā)現(xiàn)后，一個(gè)具有突破性的結(jié)論誕生了：lin-4 中的超短 RNA 與 lin-14 中 mRNA 的關(guān)鍵片段序列互補(bǔ)，正是通過(guò)這種奇妙的結(jié)合，超短 RNA 如同一個(gè)“開(kāi)關(guān)”，“關(guān)閉”了 lin-14基因的表達(dá)，阻止它產(chǎn)生蛋白質(zhì)。這一發(fā)現(xiàn)，揭開(kāi)了以前從未被知曉的、基于 microRNA 的基因調(diào)控機(jī)制。因?yàn)樵诖酥?，科學(xué)家們一直認(rèn)為是一種名為 “轉(zhuǎn)錄因子” 的特殊蛋白質(zhì)，通過(guò)與 DNA 的特定區(qū)域結(jié)合，來(lái)決定產(chǎn)生哪些 mRNA，從而實(shí)現(xiàn)基因調(diào)控。
圖2 Ambros和Ruvkun發(fā)現(xiàn)lin-4來(lái)源的microRNA過(guò)程
限于當(dāng)時(shí)的環(huán)境和人們的認(rèn)知，他們的發(fā)現(xiàn)之路并非一帆風(fēng)順。1993 年，當(dāng)Ambros和Ruvkun在《Cell》雜志上發(fā)表這一創(chuàng)新成果時(shí)，卻并沒(méi)有引起科學(xué)界過(guò)多的關(guān)注。盡管這是前所未有的重大發(fā)現(xiàn)，但科學(xué)界卻認(rèn)為這種機(jī)制可能僅僅是秀麗隱桿線蟲(chóng)的獨(dú)特特性，與人類(lèi)和其他更復(fù)雜的動(dòng)物毫無(wú)關(guān)系。
但命運(yùn)的轉(zhuǎn)折總是充滿戲劇性，2000 年時(shí)，當(dāng)Ruvkun研究小組公布他們發(fā)現(xiàn)的另一種由 let-7 基因編碼的 microRNA 時(shí)，曾經(jīng)的沉默瞬間被打破，引起了巨大的轟動(dòng)。因?yàn)榕c lin-4 不同，let-7 基因普遍存在于整個(gè)動(dòng)物界。這一驚人發(fā)現(xiàn)如同在科學(xué)界投下了一顆重磅炸彈，引發(fā)了一場(chǎng)激烈的研究熱潮。在接下來(lái)的幾年里，數(shù)百種不同的 microRNA 被一一鑒定出來(lái)。
圖3 Ruvkun克隆了第二個(gè)編碼microRNA的基因let-7，該基因在進(jìn)化中是保守的且普遍存在于整個(gè)動(dòng)物界
如今，人體內(nèi)超過(guò)一千種 microRNA 已被發(fā)現(xiàn)。可以毫不夸張地說(shuō)，沒(méi)有它們，細(xì)胞和組織就無(wú)法正常發(fā)育，而它們的異常和突變甚至可能引發(fā)癌癥等嚴(yán)重疾病。microRNA 的出現(xiàn)，就像是為生命的基因調(diào)控世界打開(kāi)了一扇全新的大門(mén)，揭示了一個(gè)全新的維度，它對(duì)所有復(fù)雜的生命形式都至關(guān)重要。
圖4 自1993-2000發(fā)現(xiàn)microRNA開(kāi)始的microRNA研究進(jìn)程
microRNA 的應(yīng)用
近些年來(lái)由于對(duì)microRNA研究的比較多，我們知道m(xù)icroRNA 是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為 22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈 RNA 分子。它通過(guò)與靶 mRNA 結(jié)合，抑制其翻譯或促進(jìn)其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。
圖5 microRNA的開(kāi)創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)揭示了基因調(diào)控的一個(gè)新維度
醫(yī)學(xué)領(lǐng)域
在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，microRNA 展現(xiàn)出了巨大的潛力，可作為疾病的重要生物標(biāo)志物。例如，眾多研究已表明，在某些癌癥中，特定的 microRNA 表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化。Lan 等人在權(quán)威期刊《Biomedical Research International》發(fā)表的論文中深入探討并強(qiáng)調(diào)了 microRNA 作為癌癥潛在生物標(biāo)志物的重大意義。以肝癌為例，大量研究發(fā)現(xiàn)，在不同類(lèi)型的癌癥（肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等）患者中，不同的microRNA的表達(dá)水平有非常明顯的變化。通過(guò)對(duì)血液中microRNA含量的精準(zhǔn)檢測(cè)，能夠?yàn)榘┌Y的早期診斷提供極為重要的參考依據(jù)。
同時(shí)，microRNA 為疾病治療開(kāi)辟了新的策略。Krützfeldt 等人在國(guó)際著名期刊《Nature》發(fā)表的研究中，創(chuàng)新性地介紹了 “antagomirs” 這種反義寡核苷酸，它可在體內(nèi)有效地沉默 microRNA。通過(guò)使用特定的 microRNA 模擬物或抑制劑，可以精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而為疾病治療帶來(lái)新的希望。在一些癌癥的治療研究中，科學(xué)家們積極探索使用 microRNA 抑制劑來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。例如，針對(duì)某些特定類(lèi)型的癌癥，研究人員發(fā)現(xiàn)特定的 microRNA 抑制劑能夠靶向作用于腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵基因，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，為癌癥治療提供了新的思路和方法。
農(nóng)業(yè)領(lǐng)域
在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，microRNA 在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性中起著至關(guān)重要的作用。Tang 和 Chu 在《Nature Plants》發(fā)表的文章中，系統(tǒng)地強(qiáng)調(diào)了 microRNA 在作物復(fù)雜性狀改良中的重要意義。通過(guò)調(diào)控植物中的 microRNA 表達(dá)，可以有效地改良農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。比如，在面對(duì)干旱、鹽堿等不良環(huán)境時(shí)，調(diào)節(jié)與植物抗逆性相關(guān)的 microRNA，可以顯著提高農(nóng)作物的耐受性。此外，還可以利用 microRNA 技術(shù)來(lái)培育具有特定性狀的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。Zhou 和 Luo 的研究深入探討了 microRNA 介導(dǎo)的基因調(diào)控在植物基因工程中的潛在應(yīng)用。通過(guò)對(duì)特定 microRNA 的調(diào)控，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的精準(zhǔn)干預(yù)，培育出具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等優(yōu)良性狀的農(nóng)作物品種，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展提供了新的技術(shù)手段。
研究方法
那么如何研究 microRNA 呢？ 常用的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)手段也是豐富多樣的，下面跟大家介紹一些常用的實(shí)驗(yàn)研究方法。
① Northern Blot
這是一種經(jīng)典的 RNA 檢測(cè)方法。通過(guò)電泳將 RNA 分離，然后將其轉(zhuǎn)移到膜上，利用特定的 microRNA 探針進(jìn)行雜交，檢測(cè) microRNA 的表達(dá)水平。雖然該方法相對(duì)較為繁瑣，但具有較高的特異性和準(zhǔn)確性。
圖6 Northern Blot檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性
② 基因芯片技術(shù)
這是一種高通量的檢測(cè)方法，可以同時(shí)檢測(cè)大量 microRNA 的表達(dá)水平。通過(guò)將已知的 microRNA 探針固定在芯片上，與樣本中的 microRNA 進(jìn)行雜交，然后利用熒光或其他信號(hào)檢測(cè)技術(shù)，快速獲取樣本中 microRNA 的表達(dá)譜。這種方法能夠全面地了解不同生理或病理狀態(tài)下 microRNA 的變化情況，為研究 microRNA 的功能提供重要線索。這種方法成本較高；可能存在假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果；對(duì)樣本的質(zhì)量和數(shù)量要求較高。
③ 實(shí)時(shí)定量 PCR（RT-qPCR）
該方法可用于特定 microRNA 的定量分析。它具有高靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出微量的 microRNA。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)特定 microRNA 的引物和探針，利用 PCR 技術(shù)對(duì) microRNA 進(jìn)行擴(kuò)增，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)變化，從而計(jì)算出 microRNA 的相對(duì)或絕對(duì)表達(dá)量。由于其操作相對(duì)方便，方法簡(jiǎn)單，通量高，已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室里面常用的一種檢測(cè)microRNA的方法了。
這種方法首先要把 RNA 提取出來(lái)，microRNA 的 qPCR 的檢測(cè)與正常的基因無(wú)明顯差異，但由于 microRNA 比較小，所以需要的特殊的反轉(zhuǎn)錄方法。常用的反轉(zhuǎn)錄方法有兩種，一種為莖環(huán)法（Stemloop specific primer），一種為加尾法（Universal primer）。
圖7 microRNA常見(jiàn)的2種反轉(zhuǎn)錄的方式
④ RNA 干擾技術(shù)
這是一種研究 microRNA 功能的有力工具。通過(guò)導(dǎo)入特定的小干擾 RNA（siRNA）或 microRNA 抑制劑，可以特異性地抑制目標(biāo) microRNA 的功能。相反，使用 microRNA 模擬物可以增強(qiáng) microRNA 的活性。通過(guò)觀察細(xì)胞或生物體在 microRNA 功能改變后的表型變化，可以推斷出 microRNA 的生物學(xué)功能。
⑤ 生物信息學(xué)分析
隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了大量的 microRNA 序列數(shù)據(jù)。生物信息學(xué)方法可以用于分析這些數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)新的 microRNA、識(shí)別 microRNA 的靶基因以及研究 microRNA 的進(jìn)化和功能保守性。例如，利用序列比對(duì)算法，可以在不同物種中尋找保守的 microRNA，從而揭示 microRNA 在進(jìn)化過(guò)程中的重要作用。
⑥ 細(xì)胞和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)
構(gòu)建細(xì)胞和動(dòng)物模型是研究 microRNA 功能的重要手段。通過(guò)在細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)或抑制特定的 microRNA，可以觀察細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程的變化。在動(dòng)物模型中，可以通過(guò)基因敲除、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)來(lái)研究 microRNA 在體內(nèi)的功能。例如，構(gòu)建 microRNA 敲除小鼠模型，可以研究特定 microRNA 在小鼠發(fā)育、生理和疾病中的作用。
圖8 整體原位microRNA 雜交（Whole-mount miRNA ISH）技術(shù)在生物發(fā)育中的應(yīng)用
⑦ microRNA 活性檢測(cè)方法
? 報(bào)告基因法：構(gòu)建含有 microRNA 靶序列和報(bào)告基因（如熒光素酶基因）的載體，當(dāng) microRNA 與靶序列結(jié)合時(shí)，會(huì)抑制報(bào)告基因的表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的活性變化，可以間接反映 microRNA 的活性。其中熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)由于操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，已廣泛的應(yīng)用于microRNA的活性及靶標(biāo)檢測(cè)。更詳細(xì)的方法可以參看下方的視頻。
復(fù)制下方鏈接，可查看完整視頻
http://www.whhj.net/technology_video.html
? Western blot 檢測(cè)靶蛋白法：microRNA 通過(guò)與靶 mRNA 結(jié)合抑制其翻譯，從而降低靶蛋白的表達(dá)水平。通過(guò) Western blot 技術(shù)檢測(cè)靶蛋白的表達(dá)量變化，可以推斷 microRNA 的活性。
? RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀法（RIP）：利用抗體特異性地結(jié)合與 microRNA 結(jié)合的 RNA 結(jié)合蛋白，然后通過(guò)免疫沉淀分離出與該蛋白結(jié)合的 RNA，包括 microRNA 和其靶 mRNA。通過(guò)檢測(cè)沉淀下來(lái)的 RNA 中 microRNA 和靶 mRNA 的含量，可以分析 microRNA 的活性及其與靶 mRNA 的結(jié)合情況。
TransGen 相關(guān)產(chǎn)品
小 RNA 提取試劑盒 (ER601)
產(chǎn)品特點(diǎn)
★ 操作安全性提高：使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿
★ 適用于從細(xì)胞、組織、新鮮血液、外泌體中提取 miRNA 和 Total RNA
★ 通過(guò)調(diào)整加入水相中無(wú)水乙醇的用量，可獲得：
1. RNA 離心柱吸附大分子量 RNA(28S rRNA, 18S rRNA, mRNA) 后，將流出液 ( 包含小于 200 nt 的 RNAs, 如 miRNA,siRNA, shRNA, snRNA 等 ) 再經(jīng) miRNA 離心柱吸附 Small RNA；
2. RNA 離心柱吸附所有 RNA( 包含小于 200 nt 的 RNA)
★ 裂解能力強(qiáng)、提取量高、應(yīng)用范圍廣
數(shù)據(jù)展示
分別用 miRNA 提取產(chǎn)品提取 miRNA，2 個(gè)重復(fù)，用 miRNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品反轉(zhuǎn)后進(jìn)行 qPCR 檢測(cè)
強(qiáng)化 RNA 提取試劑盒 (ET111)
產(chǎn)品特點(diǎn)
與其它總 RNA 提取試劑相比，裂解能力強(qiáng)、速度快，RNA 的提取量與純度更高。
? 操作安全性提高：使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿
? 適用于快速提取多種組織和細(xì)胞中的總 RNA
? 應(yīng)用范圍廣：動(dòng)物、植物組織、血液和細(xì)菌等樣品。小量樣品 (50-100 mg 組織、5×106 細(xì)胞、200 μL 血液 )。大量樣品 ( ≥1 g 組織或 ≥107 細(xì)胞 )
? 提取速度快：一個(gè)小時(shí)內(nèi)可完成反應(yīng)
? 操作可視化：溶液呈粉紅色，便于分離水相和有機(jī)相
? 提取純度高：DNA 和蛋白質(zhì)的污染低
? RNA 溶解液：便于 RNA 保存和降低對(duì)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的抑制
數(shù)據(jù)展示
TransScript? miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix
TransScript miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒 (AT351)
產(chǎn)品特點(diǎn)
★ 適用于 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 的樣品反轉(zhuǎn)錄
★ 優(yōu)化的加尾酶和反轉(zhuǎn)錄酶配比及反應(yīng)緩沖液，確保 miRNA 的反轉(zhuǎn)錄效率
★ Poly(A) 加尾和 cDNA 合成在同一反應(yīng)體系中一步完成
數(shù)據(jù)展示
? 批次間穩(wěn)定性好
使用不同批次產(chǎn)品分別以從人血漿中提取的 miRNA 為模板，進(jìn)行 qRT-PCR 檢測(cè)，根據(jù) Cq 值變化判斷該產(chǎn)品批次間的穩(wěn)定性。
? 反轉(zhuǎn)錄效率高
使用 TransGen 和 Company TA 產(chǎn)品，分別以從人血漿中提取的miRNA 為模板，進(jìn)行 qRT-PCR 檢測(cè)，根據(jù) Cq 值變化分析反轉(zhuǎn)錄效果。
TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix
TransScript 一步法 gDNA 去除及 cDNA 合成試劑盒 (AT311)
產(chǎn)品特點(diǎn)
★ 在同一反應(yīng)體系中，同時(shí)完成反轉(zhuǎn)錄與基因組 DNA 的去除，操作簡(jiǎn)便，降低污染幾率
★ 產(chǎn)物用于 qPCR：反轉(zhuǎn)錄 15 分鐘；產(chǎn)物用于 PCR：反轉(zhuǎn)錄 30 分鐘
★ 反應(yīng)結(jié)束后，同時(shí)熱失活 RT/RI 與 gDNA Remover
★ 合成片段 ≤12 kb
數(shù)據(jù)展示
? 反轉(zhuǎn)錄效率高
? 高效基因組去除
使用不同批次產(chǎn)品分別以人 100 ng 總 RNA、人 100 ng 總 RNA+200 ng gDNA、200 ng gDNA 為模板，進(jìn)行 RT-PCR 檢測(cè)，1.0% 瓊脂糖凝膠電泳分析模板 DNA 去除效果；qRT-PCR 檢測(cè) 18S DNA 表達(dá)量。
PerfectStart? Green qPCR SuperMix
染料法熒光定量預(yù)混試劑（AQ601）
產(chǎn)品特點(diǎn)
★ 3 種抗體封閉，特異性高，靈敏度高，擴(kuò)增效率強(qiáng)，適用物種范圍廣
★ 雙陽(yáng)離子緩沖液，增強(qiáng)特異性，減少引物二聚體形成，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確
★ 配有適用于不同機(jī)型的 Universal Passive Reference Dye ( 調(diào)整 PCR 加樣誤差引起的管間差異 )，校正孔間信號(hào)誤差
數(shù)據(jù)展示
? 擴(kuò)增效率高
以梯度稀釋的質(zhì)粒 DNA (10 ng ～ 0.1 pg，10 倍稀釋 ) 為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，TransGen 產(chǎn)品擴(kuò)增效率較高，可得到漂亮的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
? 不同物種模板擴(kuò)增
以不同物種的 RNA 反轉(zhuǎn)錄 (TransGen, AT311) 后得到的 cDNA 為模板分別使用 TransGen 與 Company T 的產(chǎn)品進(jìn)行擴(kuò)增 (NTC 無(wú)擴(kuò)增 )。結(jié)果顯示，TransGen 產(chǎn)品擴(kuò)增效果與 Company T 產(chǎn)品基本一致。
產(chǎn)品信息
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展望
對(duì) microRNA 的未來(lái)研究充滿期待。在研究方向上，科學(xué)家們將進(jìn)一步深入探索 microRNA 在不同生理和病理過(guò)程中的作用機(jī)制，以及與其他基因調(diào)控因子的相互關(guān)系。在疾病治療方面，有望開(kāi)發(fā)出基于 microRNA 的新型藥物，為癌癥等嚴(yán)重疾病的治療帶來(lái)新的突破。同時(shí)，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì) microRNA 的檢測(cè)和調(diào)控方法也將更加精準(zhǔn)和高效。
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