Q：蛋白不表達(dá)或表達(dá)量很低？
A：
1、選擇正確的表達(dá)載體與表達(dá)菌株
? T7啟動(dòng)子的載體(如pET系列載體)應(yīng)選用BL21(DE3)，BL21(DE3) pLysS，Transetta(DE3) 等菌株。非T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體 (如Tac啟動(dòng)子的pGEX、pMAL系列表達(dá)載體) 應(yīng)選用BL21表達(dá)菌株。
? 對(duì)細(xì)胞有毒性的蛋白，建議選用背景表達(dá)低、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控誘導(dǎo)的菌株，如BL21(DE3) pLysS菌株。
? 對(duì)于帶有稀有密碼子的蛋白或來(lái)源于真核基因的蛋白，建議選用Transetta(DE3) 等菌株。
2、嘗試不同的表達(dá)載體與菌株
不同的蛋白，對(duì)不同載體與菌株的偏好不同，如果某一蛋白無(wú)法通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件得到明顯改善，可以更換其它菌株或表達(dá)載體。
3、表達(dá)條件的優(yōu)化
? 選擇不同的培養(yǎng)基。對(duì)于某些蛋白，在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖(0.1%-0.5%)，可以明顯提高表達(dá)量。
? 較高的溫度、較高的誘導(dǎo)物濃度、較長(zhǎng)的表達(dá)時(shí)間，一般可以加快表達(dá)的速度，促進(jìn)目的蛋白的積累，從而提高表達(dá)量。但可能會(huì)降低可溶蛋白的表達(dá)量，形成包涵體。
? 細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)蛋白表達(dá)有很大的影響，可以通過(guò)測(cè)量菌液的OD600值監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)狀態(tài)。對(duì)于大部分蛋白，應(yīng)在菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=0.5) 進(jìn)行誘導(dǎo)。
Q：目的蛋白不可溶，形成包涵體？
A：
首先確認(rèn)目的蛋白是否有表達(dá)。
? 裂解菌體并離心后，通過(guò)對(duì)全菌、上清、沉淀的檢測(cè)，確認(rèn)目的蛋白是否表達(dá)，是否形成了包涵體。
? 包涵體的形成與蛋白自身結(jié)構(gòu)、表達(dá)系統(tǒng)、誘導(dǎo)表達(dá)條件等因素有著密切關(guān)系。在無(wú)法改變蛋白自身結(jié)構(gòu)的情況下，可以嘗試不同的表達(dá)載體與菌株，增強(qiáng)其溶解能力，優(yōu)化出適合特定蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。
? 目前認(rèn)為包涵體的形成是由于蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累速度過(guò)快，沒(méi)有正確折疊而聚集沉淀。可以通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，如降低誘導(dǎo)溫度、降低誘導(dǎo)物濃度、縮短表達(dá)時(shí)間、降低誘導(dǎo)時(shí)菌液的OD值等，以減緩蛋白的積累。
Q：目的蛋白大小不正確？
A：
? 蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)判斷分子量大小有一定影響?？梢酝ㄟ^(guò)加熱變性蛋白，從而準(zhǔn)確判斷蛋白分子量大小。
? 確認(rèn)蛋白表達(dá)是否完整，蛋白是否提前終止表達(dá)。
? 若形成二聚體甚至多聚體，可以通過(guò)加熱變性蛋白、打開(kāi)二硫鍵 (加入DTT、β-ME等還原劑) 等手段，破壞次級(jí)結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確判斷分子量大小。
RNA純化常見(jiàn)問(wèn)題解答
Q：提取過(guò)程中 RNA 降解
A：
? 材料中的 RNA 發(fā)生降解：盡量選擇新鮮的材料，材料采集后應(yīng)迅速用液氮處理。材料
保存在液氮中或 -70℃條件下，材料均不宜長(zhǎng)期保存，且避免反復(fù)凍融。幼嫩新鮮的材料 RNA 含量高且完整，衰老或病害等受損的材料中 RNA 降解比較嚴(yán)重。
? 操作環(huán)境的 RNase 污染：RNA 提取盡量選擇潔凈的環(huán)境，由于自然條件下空氣中含有較多的 RNase，建議對(duì)提取環(huán)境進(jìn)行 RNase 的清除處理。
? 提取用具帶來(lái)的 RNase污染：提取用所有的玻璃器皿可通過(guò)高溫滅活 (160℃烘烤 4-5 小時(shí))去除 RNase。RNA 材料所接觸的所有塑料制品 (如槍頭、電泳槽、移液器等)都需要通過(guò) DEPC 或 NaOH 處理嚴(yán)格去除 RNase 后才可使用。
? 操作中帶入的 RNase 污染：人的皮膚、汗液和呼出的氣體中含有大量的 RNase。操作人
員可通過(guò)經(jīng)常更換一次性手套，佩戴口罩等措施減少此類污染。
Q：RNA 提取量低
A：
? 材料 RNA 含量較低：對(duì)于 RNA 含量較低的纖維組織 (肌肉組織或纖維素較高的植
物組織) 可適當(dāng)提高起始材料的用量。
? 材料中蛋白和脂肪含量較高：蛋白和脂肪含量較高的材料可用氯仿對(duì)上清再次抽提。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例為嚴(yán)
格的 1:1，否則會(huì)明顯影響 RNA 沉淀的效率和 RNA 的純度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通過(guò)添加適量的檸檬酸鈉來(lái)改善沉淀效果。
Q：RNA 中有基因組 DNA 污染
A：
? 材料中核酸含量高：脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高，可進(jìn)行多次酚 / 氯仿抽
提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理，降解 DNA。
? 材料過(guò)量：增加試劑用量。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例偏高，
溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。
Q：提取后的 RNA 樣品降解
A：
? RNA 樣品反復(fù)凍融：反復(fù)凍融會(huì)使 RNA 片段斷裂，影響 RNA 的完整性。
? RNA 樣品保存條件不合適：根據(jù)保存時(shí)間和材料的不同，RNA 應(yīng)保存在不同的溶液中。
如從胰臟、肝臟等 RNase 含量較高的材料中提取的樣品需要儲(chǔ)存在甲醛或甲酰胺中以保存高質(zhì)量的 RNA，而在脾臟中提取的 RNA 可在水中長(zhǎng)期穩(wěn)定保存。
